Ингибиторы полимеразной цепной реакции - Polymerase chain reaction inhibitors

Ингибиторы ПЦР являются факторами, препятствующими усилению нуклеиновых кислот сквозь полимеразной цепной реакции (ПЦР).[1] Ингибирование ПЦР - наиболее частая причина неудач амплификации при наличии достаточного количества копий ДНК.[2] Ингибиторы ПЦР обычно влияют на ПЦР через взаимодействие с ДНК или вмешательство в ДНК-полимераза. Ингибиторы могут избежать удаления во время процедуры очистки ДНК за счет прямого связывания с одноцепочечной или двухцепочечной ДНК.[3] В качестве альтернативы, уменьшив доступность кофакторы (например, Mg2+) или иным образом препятствуя их взаимодействию с ДНК-полимеразой, ПЦР ингибируется.[3]

В мультиплексная ПЦР реакции, различные последовательности могут страдать от различных эффектов ингибирования в разной степени, что приводит к несоответствию в их относительных амплификациях.[3]

Типы ингибиторов

Ингибиторы могут присутствовать в исходном образце, таком как кровь, ткани, ткани и почва, но также могут быть добавлены в результате обработки образцов и используемых методов экстракции ДНК.[3] Избыточные соли, включая KCl и NaCl, ионные моющие средства такие как деоцихолат натрия, саркозил и SDS этанол, изопропанол и фенол, среди прочего, через различные механизмы ингибирования способствуют снижению эффективности ПЦР.[3]

Количественная оценка степени ингибирования

Чтобы попытаться оценить степень ингибирования, происходящего в реакции, можно выполнить контроль, добавив известное количество шаблона к исследуемой реакционной смеси (на основе анализируемого образца). Путем сравнения амплификации этой матрицы в смеси с амплификацией, наблюдаемой в отдельном эксперименте, в котором та же самая матрица используется в отсутствие ингибиторов, можно сделать вывод о степени ингибирования в исследуемой реакционной смеси.[4][3] Конечно, если какая-либо часть ингибирования, происходящего в реакционной смеси, полученной из образца, является последовательностью, то этот метод даст заниженную оценку ингибирования, поскольку он применяется к исследуемой последовательности (последовательностям).

Предотвращение ингибирования ПЦР

Сбор образцов

Метод отбора проб можно усовершенствовать, чтобы избежать ненужного сбора ингибиторов. Например, в судебной медицине перенос мазка крови на ткань или слюны на пищу может предотвратить или уменьшить загрязнение ингибиторами, присутствующими в ткани или пище.[3]

Очистка ДНК

Существуют методы и коммерчески доступны наборы, позволяющие извлекать ДНК за исключением некоторых ингибиторов.[3]

Компоненты реакции ПЦР

Помимо методов удаления ингибиторов из образцов перед ПЦР, некоторые ДНК-полимеразы обладают различной устойчивостью к различным ингибиторам, а увеличение концентрации выбранной ДНК-полимеразы также придает некоторую устойчивость к ингибиторам, нацеленным на полимеразу.[3]

Для ПЦР на основе образцов крови добавление бычий сывороточный альбумин снижает влияние некоторых ингибиторов на ПЦР.[3]

Смотрите также

использованная литература

  1. ^ Уилсон, Ян (октябрь 1997 г.). «Ингибирование и облегчение амплификации нуклеиновых кислот». Прикладная и экологическая микробиология. 63 (10): 3741–3751. ЧВК  168683. PMID  9327537.
  2. ^ Алаэддини, Реза (2012). «Судебные последствия ингибирования ПЦР - обзор». Международная судебная экспертиза: генетика. 6 (3): 297–305. Дои:10.1016 / j.fsigen.2011.08.006.
  3. ^ а б c d е ж г час я j «Введение в ингибиторы ПЦР (Promega Corporation)» (PDF). Получено 2007-12-15.
  4. ^ Gieffers J, Reusche E, Solbach W, Maass M (2000). «Неспособность обнаружить Chlamydia pneumoniae в срезах мозга пациентов с болезнью Альцгеймера». J. Clin. Микробиол. 38 (2): 881–2. ЧВК  86233. PMID  10655406.