Аптамер шпината - Spinach aptamer

Необходимость флуоресцентного отслеживания РНК выросла, поскольку его роль в сложных клеточных функциях выросла и теперь включает не только мРНК, рРНК, и тРНК, но также РНКи, миРНК, snoRNA, и днРНК, среди прочего.[1][2] Шпинат - это синтетический РНК-аптамер, возникший из-за необходимости изучения роли РНК на клеточном уровне.[3] Этот аптамер был создан с использованием Systematic Evolution for Ligands путем экспоненциального обогащения или SELEX, который также известен как эволюция in vitro.[4]

Метод SELEX, используемый для дизайна РНК-аптамера Spianch.

Аптамер был разработан, чтобы быть имитатором РНК зеленый флуоресцентный белок (GFP); Подобно GFP для белков, шпинат можно использовать для флуоресцентной маркировки РНК и отслеживания ее in vivo. Легко доступен способ вставки последовательности шпината после интересующей последовательности РНК.[5][6]

GFP флуорофор состоит из трех циклизованных аминокислот в бета-цилиндрической структуре: серин65-тирозин66-глицин67. Эта структура, 4-гидроксибензлиденимидазолинон (HBI), была основой синтетического аналога, используемого в исследованиях SELEX. Многие производные этой структуры были проверены с помощью SELEX, но выбранный флуорофор, 3,5-дифтор-4-гидроксибензилиденимидазолинон (DFHBI), показал лучшую селективную флуоресценцию с высокой квантовый выход (0,72) при связывании с последовательностью РНК 24-2 считается шпинатом.

РНК-аптамер шпината. PDB: 4KZD
Кристаллическая структура PDB шпината: 4KZD [1]

Было установлено, что DFHBI связывает шпинат только в фенолятной форме. При pH <6,0 обнаруживаются как фенольная, так и фенолятная формы. При pH = 6,0 обнаруживается только пик фенолята. DFHBI также невероятно прочен и устойчив к фотообесцвечивание в течение длительного периода времени по сравнению с HBI и EGFP. Считается, что свободный обмен связанного и несвязанного лиганда позволяет такое сохранение. Поскольку флуорофор GFP и его производные ковалентно связаны с / частью белка, свободный обмен не может происходить, и, следовательно, происходит фотообесцвечивание.

Шпинат представляет собой структуру длиной 84 нуклеотида с двумя спиральными цепями и внутренним выступом с G-квадруплекс мотив. Именно с этим G-квадруплексом связывается флуорофор. Согласно кристаллографическим данным, после связывания флуорофора с молекулой происходит массивная перестройка соседних оснований. Однако это связывание является благоприятным, поскольку оно способствует накоплению оснований в обычно нестабильной области, то есть внутренней выпуклости. Подобно GFP, DFHBI также дегидратируется, что способствует его высокому квантовому выходу.

Шпинат также адаптирован для восприятия белков или молекул in vivo. Адаптированная структура, которая включает два сайта связывания, ограничивает флуоресценцию аптамера (1) флуорофором и (2) белком или небольшой молекулой.

Рекомендации

  1. ^ http://www.umassmed.edu/rti/biology/role-of-rna-in-cells/
  2. ^ http://www.umassmed.edu/rti/biology/role-of-rna-protein-in-synthesis/
  3. ^ Huang, H .; Суслов, Н.Б .; Li, N.S .; Shelke, S.A .; Evans, M.E .; Колдобская, Ю .; Rice, P.A .; Piccirilli, J.A. (Август 2014 г.). «РНК, содержащая G-квадруплекс, активирует флуоресценцию в GFP-подобном флуорофоре». (2014) ". Nat. Chem. Биол. 10 (8): 686–691. Дои:10.1038 / nchembio.1561. ЧВК  4104137. PMID  24952597.
  4. ^ Levine, HA; Нильсен-Гамильтон, М (2007). «Математический анализ SELEX». Вычислительная биология и химия. 31 (1): 11–35. Дои:10.1016 / j.compbiolchem.2006.10.002. ЧВК  2374838. PMID  17218151.
  5. ^ Strack, Rita L; Дисней, Мэтью Д; Джеффри, Сэми Р. (2013). "Свертывание Spinach2 раскрывает динамическую природу РНК, содержащей тринуклеотидный повтор". Методы природы. 10 (12): 1219–1224. Дои:10.1038 / nmeth.2701. ISSN  1548-7091. ЧВК  3852148. PMID  24162923.
  6. ^ Paige, J. S .; Wu, K. Y .; Джеффри, С. Р. (2011). «РНК, имитирующая зеленый флуоресцентный белок». Наука. 333 (6042): 642–646. Bibcode:2011Научный ... 333..642С. Дои:10.1126 / science.1207339. ISSN  0036-8075. ЧВК  3314379. PMID  21798953.

внешняя ссылка